Многоугловое рассеяние света в сочетании с эксклюзионной хроматографией (SEC-MALS) | Статья
Данный метод обеспечивает точное определение молекулярной массы белков и других макромолекул независимо от их конформации. SEC-MALS представляет собой точный и принципиально новый метод анализа молярной массы, который не требует определения времени удерживания или калибровок. Функция хроматографической колонки состоит в том, чтобы разделить макромолекулы в зависимости от их размера, в то время как MALS определяет молекулярную массу элюируемых белков независимо.
Основы метода
Многоугловое рассеяние света представляет собой метод для измерения абсолютной молекулярной массы, использующий зависимость между интенсивностью света, рассеянного молекулой, и её молекулярной массой и размером согласно теории Рэлея.
В оптически прозрачной и однородной среде плоская волна распространяется только в одном направлении, без какого-либо рассеяния в стороны. Рассеяние наблюдается в оптически неоднородных средах, возникая при изменении показателя преломления. Оптическая неоднородность среды обусловлена присутствием в ней диспергированных частиц. Рассеяние света происходит из-за того, что при прохождении через некоторую среду электромагнитной волны молекулы или частицы этой среды поглощают часть энергии волны и затем излучают долю этой энергии в окружающее пространство. В результате происходят изменения характеристик потока электромагнинтного излучения: пространственного распределения интенсивности, частотного спектра, поляризации.
По характеру изменения частоты излучения различают неупругое рассеяние (к нему относится, например, комбинационное рассеяние), сопровождающееся появлением в рассеянном свете линий с частотой ω0 ± Ω, смещенных по частоте относительно возбуждающего излучения ω0, и упругое рассеяние, происходящее без существенного изменения частоты ω ≈ ω0. Методы статического (в т.ч. многоуглового) и динамического светорассеения основаны на регистрации упругого рассеяния света и вычислении радиуса инерции, который связан с массой макромолекулы
Для более эффективного применения MALS-детекторов их используют в сочетании с гель-проникающей (экслюзионной) хроматографией. В основе гель-проникающей хроматографии лежит разделение молекул вещества по размеру за счёт различия между ними в способности проникать в поры неподвижной фазы (геля). При этом, первыми из колонки выходят молекулы с наибольшей молекулярной массой, способные проникать в минимальное число пор. Молекулы с малыми размерами выходят последними. Преимущество гель-проникающей хроматографии состоит в том, что между подвижной фазой и сорбентами нет никаких химических взаимодействий, и разделяемые вещества могут быть далее использованы в других экспериментах.
