Техническая и методическая поддержка
Научно-технические консультации
Поставка, установка, инжиниринг

+7 (495) 256-24-84 info@lab-test.ru

Спектрофлуориметры с разрешением по времени и счетом фотонов

В настоящее время методы флуоресцентного анализа играют всё большую роль в исследованиях биологических макромолекул, внутриклеточных структур, их функционирования в клетках и биологических тканях. Флуоресценция характеризуется целым рядом параметров, такими как спектр, интенсивность, поляризация, квантовый выход и другие. Эти параметры в отдельности или в комбинации друг с другом используются для количественных и качественных исследований биоорганических соединений.

Важнейшей характеристикой флуоресценции является время жизни флуоресценции – усреднённое время существования макромолекул в возбуждённом состоянии. Определение этого параметра используется в исследованиях структуры, динамики и функций биологических макромолекул.

  • Во-первых, время жизни флуоресценции зависит от параметров среды, в которой находится флуорофор, и поэтому определение этого параметра даёт исследователю информацию о особенностях внутриклеточной среды, влиянии растворителя, ионной силы, pH и локализации флуорофорных групп на молекулу, находящуюся в возбуждённом состоянии.
  • Во-вторых, определение времени жизни флуоресценции может быть использовано при исследовании межмолекулярных взаимодействий. Если в исследуемой системе присутствуют два хромофора, то между ними возможен процесс переноса энергии, при котором молекула донора переходит из возбужденного состояния в основное, передавая свою энергию молекуле акцептора. Передача возбуждения может проходить по излучательному или безызлучательному механизму. Механизмы переноса различают по зависимости времени жизни флуоресценции донора от концентрации акцептора. При излучательном переносе время жизни флуоресценции донора не зависит от концентрации акцептора, при безызлучательном переносе уменьшается с увеличением концентрации. Полученные данные о изменении времени жизни флуоресценции могут быть использованы для определения расстояния между молекулами донора и акцептора.
  • В-третьих, определение времени жизни флуоресценции позволяет изучать кинетику реакций с участием возбуждённых молекул. Измерение времени жизни флуоресценции в присутствии тушителей позволяет определить определить механизм гашения флуоресценции, вычислить константу скорости тушения и концентрацию молекул-гасителей. Наконец, время жизни флуоресценции является специфической характеристикой флуорофора, это может быть использовано при исследовании смесей флуорофоров похожими спектральными характеристиками.

Для определения времени жизни флуоресценции в современных спектрофлуориметрах используются 2 основных метода:

  1. Импульсные методы, когда возбуждение флуоресценции происходит за счёт одиночных или периодически повторяемых импульсов света. При этом время жизни флуоресценции определяется в режиме счёта фотонов.
  2. Фазово-модуляционные методы, в которых возбуждение флуоресценции производится непрерывным источником света, интенсивность которого модулируется с определённой частотой. Время жизни флуоресценции определяется по фазе и (или) глубине модуляции испускаемого излучения.

Ещё одним параметром, который часто интересует исследователей, является корреляционное время вращения. Этот параметр отражает скорость вращательного движения флуорофора. По изменению корреляционного времени вращения можно судить об изменении размера макромолекул (например, из-за гидратации) и о соотношении внутренней подвижности флуорофорной группы с общей подвижностью макромолекулы, влиянии вязкости анизотропией флуоресценцией, потеря анизотропии описывается как моноэкспонинциальная зависимость от времени. Корреляционное время вращения также является характеристикой флуорофора, и определяется из зависимости затухания анизотропии флуоресценции.

Спектрофлуориметры компании ISS сочетают технологии счёта фотонов и модуляции возбуждения флуоресценции с использованием различных источников света и детекторов с последующей цифровой обработкой сигнала. Всё это даёт возможность определять время жизни флуоресценции и коорреляционное время вращения в диапазоне от пикосекунд до секунд.

Кроме этого, флуориметры компании ISS могут быть использованы для:

  • Регистрации спектров возбуждения и эмиссии;
  • получения кинетических кривых;
  • измерения интенсивности;
  • анизотропии флуоресценции на выбранных длинах волн.

Выбор конфигурации спектрофлуориметра зависит от задач, которые стоят перед пользователем.