Анализаторы макромолекул и наночастиц

Для получения характеристик произвольных макромолекул, олигомеров и частиц в растворе зачастую используются анализаторы, работающие по методам динамического рассеяния света (DLS) и рэлеевского рассеяния. С помощью этих методов можно определить молярную массу, второй вириальный коэффициент, среднеквадратичный и гидродинамический радиусы взвешенных частиц.

Эти методы реализуются без использования калибровочных стандартов.

Метод рэлеевского рассеяния предполагает определение функции распределения по углу усредненной по времени интенсивности рассеянного излучения в плоскости, включающей в себя направление распространение лазерного излучения. Метод рэлеевского рассеяния позволяет определять молярную массу, среднеквадратичный радиус и второй вириальный коэффициент макромолекул.

Второй тип измерений, метод динамического рассеяния, позволяет определить гидродинамический радиус взвешенной частицы или макромолекулы. Метод основывается на измерении автокорреляционной функции интенсивности света. При этом интенсивность света рассматривается как функция от времени. Динамическая неустойчивость рассеянного света определяется флуктуациями плотности в среде, вызванными движением взвешенных частиц, или макромолекул.

Существует два режима измерения рассеянного света: интегральный режим и режим хроматографии. Интегральный режим измерения, или режим последовательных измерений предполагает анализ раствора с однородным распределением частиц в нем. Если при использовании методики рэлеевского рассеяния присутствуют частицы с различной массой, то измеренные характеристики будут усреднены по массовому распределению (определение молярной массы) и по его наивысшему моменту (определение среднеквадратичного радиуса). Реализация режима последовательных измерений в методе динамического рассеяния позволяет получить частотное (вероятностное по времени) распределение гидродинамического радиуса, обусловленное наличием фракций в растворе.

Рисунок 1. Схемы выполнения измерений в режиме хроматографии.
1- персональный компьютер, 2 - растворитель, 3 - насос,
4 - инжектор, 5 - разделитель, 6 - излучатель и анализатор рассеяния,
7 - детектор концентрации частиц, 8 - остаточные продукты.

Режим хроматографии (см. рис.1) - режим исследования взвешенных частиц методом лазерного рассеяния, который включает в себя предварительное разделении раствора на фракции. Указанный режим позволяет построить пространственное распределение по молярной массе и размеру частиц. На рис.1 приведена схема выполнения измерений в режиме хроматографии. Анализатор рассеянного света и детектор концентрации частиц последовательно соединены между собой и включены в общую схему после устройства по разделению на фракции - разделителя. Рассеянный свет и концентрация частиц каждой растворенной фракции в итоге анализируются независимо, что позволяет определить распределение молярной массы и размера частиц по фракциям.

Предварительное разделение раствора на фракции может быть выполнено при помощи метода асимметричного потока.
К потоку плоского ламинарного слоя жидкости, локализованного между двумя пластинами, прикладывается объемная сила, которая направлена перпендикулярно потоку. Движение растворенных частиц к нижней пластине приводит к возникновению неоднородности распределения частиц в области между пластинами. Возникновение обратной диффузии частиц происходит селективно: частицы с более высокой подвижностью быстрее достигают области пониженной концентрации. Данная область сосредоточена в центральной области ламинарного течения, которое имеет параболический профиль распределения скорости в сечении. Подвижные частицы также быстрее распространяются вниз по потоку. Таким образом, создается пространственное разделение фракций.

Верхняя и нижняя пластина разделена плоским разделителем толщиной 100-500 мкм. С противоположных концов пластины соединены. Верхняя пластина является непроницаемой, нижняя частично проницаема и имеет нижний предел фильтрации по массе частиц равный 104 а.е.м. Поток, используемый для реализации метода проходит через нижнюю пластину, в то время, как образец, инжектируемый перпендикулярно основному потоку, локализуется в области нижней пластины.

Рисунок 2. Схема разделения фракций методом асимметричного потока.

На рис.2 представлена схема метода асимметричного потока. Процесс разделения осуществляется в 2 этапа. На первом этапе основной поток инжектируется с обоих концов. При этом балансировка происходит так, что область компрессии встречных потоков находится под инжектором образца. Основной поток протекает через мембрану, а частицы образца распределяются за счет диффузионных процессов создавая, соответствующее распределение скорости возвращения фракций. После завершение инжекции образца проходит установление равновесия пространственного распределения фракций. Затем поток заново создается со стороны инжектора входящего потока (рис.2) и выходит со стороны инжектора исходящего потока вместе с пространственно разделенными фракциями образцы, которые поступают на анализатор.

Справочное дополнение. Расчетные теоретические соотношения.

Для более полного понимания теоретических основ метода лазерного рассеяния приведем расчетные формулы для метода динамического рассеяния и метода классического рассеяния Рэлея.

Метод динамического рассеяния: базовые соотношения.

При рассеянии лазерного излучения в объеме образца раствора интенсивность рассеянного света непостоянна по времени. Это связано с наличием флуктуаций плотности раствора, а также с броуновским движением взвешенных в растворе частиц. В методе динамического рассеяния ход интенсивности рассеянного света определяется быстрым счетчиком фотонов. При этом коэффициент диффузии в растворе связан с флуктуационными характеристиками и в конечном счете с второй корреляционной функцией интенсивности рассеянного света (соотношения 1,2). Здесь g2(t) - вторая автокорреляционная функция, I(t) - интенсивность рассеянного света, Г - время распада автокорреляции, D - коэффициент диффузии, а k - волновое число рассеянного света. Квадратные скобки обозначают усреднение по времени.

В соотношении (1) МНК аппроксимация второй автокорреляционной функции соответствует модели монодисперсной среды (присутствует один тип частиц). Поэтому приводимое описание позволяет выявлять усредненные по объему характеристики. Отметим, что волновое число рассеянного излучения является функцией угла наблюдения.

При известной средней динамической вязкости раствора μ и его температуре T может быть определен средний гидродинамический радиус диффундирующей частицы Rh (3). В соотношении (3) коэффициент k соответствует постоянной Больцмана.

Метод классического рассеяния Рэлея: базовые соотношения.

При описании рассеяния лазерного излучения в объеме образца можно рассматривать ситуацию, когда характерный размер неоднородностей R << λ, где λ - длина волны лазерного излучения. Выполнение этого условия позволяет рассматривать объемное рассеяния на различных неоднородностей как некоррелированное излучение и применить модель описания Рэлея - Дэбая. Указанная модель рассчитана для коллективного рассеяния на группе независимых неоднородностей с характерным радиусом. Модель Рэлея - Дэбая позволяет получить выражение для углового распределения интенсивности рассеянного излучения как функции среднеквадратичного радиуса неоднородности <rg2>. Угловые скобки < > здесь имеют смысл усреднения по массе. Если рассеяние происходит на макромолекулах, которые состоят из набора элементов массой mi , то среднеквадратичный радиус может быть рассчитан на основании соотношения (4). Здесь ri - расстояние от выбранного начала отсчета до центра i - го элемента, а M - совокупная масса макромолекулы.

Второй характеризующий параметр, который может быть определен в рамках модели классического рассеяния - второй вириальный коэффициентA2  для разложения в ряд осмотического давления раствора. Второй вириальный коэффициент может быть выражен при помощи уравнение Дэбая (6), преобразованного Ф.Виаттом [P.J. Wyatt, Anal. Chim. Acta 272, 1-40 (1993)]:

Здесь R(θ,c) - отношение интенсивности света, рассеянного на растворе, к соответствующей интенсивности для такого же объема растворителя. Mw - молярная масса растворенного вещества, усредненная по массе. Выражение для коэффициента K представлено выше (7). Коэффициент Kсодержит обратную степенную зависимость от длины волны лазерного излучения в вакууме - закономерность характеризующая модель Рэлея. Пропорциональная связь между приведенной интенсивностью рассеянного излучения и выражением Коэффициент P(θ) в выражении (6) - функция угла, связанная со среднеквадратичным радиусом соотношением (5). Здесь n0 - показатель преломления однородной среды (растворителя), λ0 - длина волны лазерного излучения в вакууме, θ - угол наблюдения рассеянного излучения. Приведенное выражение за вычетом O - малое удовлетворительно описывает угловое распределение при среднеквадратичном радиусе <rg2> не более 50 нм.

Таким образом, сопоставляя результаты нескольких измерений, выполненных при помощи метода классического рассеяния Рэлея, есть возможность получить среднеквадратичный радиус неоднородности (макромолекулы), а также второй вириальный коэффициент. Знание последнего позволяет построить второе приближение для зависимости осмотического давления от температуры и молекулярной плотности растворенного вещества.